關(guān)于征求《水質(zhì) 浮游植物的測定 顯微鏡計數(shù)法(征求意見稿)》
等2項(xiàng)國家生態(tài)環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)意見的通知
為貫徹《中華人民共和國環(huán)境保護(hù)法》，規(guī)范生態(tài)環(huán)境監(jiān)測工作，我部編制了《水質(zhì) 浮游植物的測定 顯微鏡計數(shù)法》等2項(xiàng)國家生態(tài)環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)征求意見稿。按照國家生態(tài)環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)制修訂工作規(guī)則要求，現(xiàn)公開征求意見(征求意見稿及編制說明，可登錄我部網(wǎng)站“意見征集”欄目檢索查閱)。
各有關(guān)單位和個人均可提出意見和建議。請將意見建議書面反饋我部，并注明聯(lián)系人及聯(lián)系方式，電子文檔同時發(fā)送至聯(lián)系人郵箱。征求意見截止時間為2021年4月23日。
聯(lián)系人：生態(tài)環(huán)境部監(jiān)測司曹宇
地址：北京市東城區(qū)東安門大街82號
郵編：100006
附件：1.水質(zhì) 浮游植物的測定 顯微鏡計數(shù)法(征求意見稿)
2.《水質(zhì) 浮游植物的測定 顯微鏡計數(shù)法(征求意見稿)》編制說明
3.水質(zhì)7種苯氧羧酸類除草劑的測定 高效液相色譜法(征求意見稿)
4.《水質(zhì)7種苯氧羧酸類除草劑的測定 高效液相色譜法(征求意見稿)》編制說明
生態(tài)環(huán)境部辦公廳
2021年3月24日
(此件社會公開)
水質(zhì) 浮游植物的測定顯微鏡計數(shù)法
(意見征求稿)
1 適用范圍
本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了測定水中浮游植物的顯微鏡計數(shù)法。
本標(biāo)準(zhǔn)適用于地表水中浮游植物的測定。
當(dāng)使用0.1 ml計數(shù)框，樣品濃縮50倍時，對角線方式方法檢出限為 9.2×103 cells/L；行格方式方法檢出限為3.0×103 cells/L；全片方式方法檢出限為9.2×102 cells/L；隨機(jī)視野
方式的方法檢出限與觀察的視野數(shù)、顯微鏡視野面積有關(guān)，按附錄A計算。
2 規(guī)范性引用文件
本標(biāo)準(zhǔn)引用了下列文件或其中的條款。凡是不注日期的引用文件，其有效版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。
HJ/T 91 地表水和污水監(jiān)測技術(shù)規(guī)范
HJ 494 水質(zhì)采樣技術(shù)指導(dǎo)
3 術(shù)語和定義
下列術(shù)語和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。
3.1
浮游植物 phytoplankton
在水中營浮游生活的藻類植物，通常浮游植物就是浮游藻類，包括原核的藍(lán)藻門和其它各類真核藻類。
3.2
顯微鏡計數(shù)視野 microscope counting field
顯微鏡視野中一定面積的計數(shù)區(qū)域。
3.3
檢出限 detection limit
在 99%概率下，樣品中可被檢測到的最低浮游植物密度。
4 方法原理
在顯微鏡下，對樣品中的浮游植物進(jìn)行人工分類和計數(shù)，計算單位體積樣品中各種類浮游植物的細(xì)胞數(shù)量。
5 試劑和材料
除非另有說明，分析時均使用符合國家標(biāo)準(zhǔn)的分析純試劑，實(shí)驗(yàn)用水為新制備的去離子水或蒸餾水。
5.1 碘化鉀(KI)。
5.2 碘(I2)。
5.3 甲醛溶液：ω(CH2O)=37%。
5.4 魯哥氏液(Lugols solution)
稱取 60 g 碘化鉀(5.1)，溶于 1000 ml 水中，再加入 40 g 碘(5.2)，充分?jǐn)嚢枋蛊淙芙?，靜置 24 h 以上。魯哥氏液在室溫避光條件下可保存 1 年。
6 儀器和設(shè)備
6.1 浮游生物網(wǎng)：25 號篩絹網(wǎng)，網(wǎng)孔直徑為 0.064 mm，網(wǎng)呈圓錐形，網(wǎng)口套在銅環(huán)上，網(wǎng)底端有出水開關(guān)活塞。
6.2 采樣瓶：30 ml 棕色玻璃廣口瓶(具塞)。
6.3 顯微鏡：物鏡 4×、10×、20×、40×，目鏡 10×或 15×。
6.4 濃縮裝置：筒形分液漏斗，1 L。
6.5 樣品瓶：50 ml 的棕色玻璃廣口瓶(具塞)。
6.6 超聲波發(fā)生裝置：工作頻率 40 kHz。
6.7 微量移液器：100 μl。
6.8 藻類計數(shù)框：0.1ml、面積 20 mm×20 mm，框內(nèi)劃分橫直各 10 行格，共 100 個小方
格。
6.9 蓋玻片：面積 22 mm×22 mm，厚度小于 0.2 mm。
6.10 計數(shù)器。
6.11 顯微鏡物鏡測微尺。
6.12 顯微鏡目鏡測微尺。
6.13 一般實(shí)驗(yàn)室常用儀器和設(shè)備。
7 樣品
7.1 樣品的采集
7.1.1 定性樣品
使用浮游生物網(wǎng)(6.1)采集定性樣品。關(guān)閉浮游生物網(wǎng)底端出水開關(guān)活塞，在水面表層至0.5 m水深處(或根據(jù)研究需要確定的其他水深)，以20 cm/s——30 cm/s的速度緩慢做“∞”形往復(fù)拖動約 1 min——3 min；也可沿表層至 0.5 m 水深處緩慢拖動，濾過 1.5 m3——5.0 m3體積的水體。將浮游生物網(wǎng)(6.1)提出水面，水體自然通過網(wǎng)孔，待底部還剩少許水體(5 ml——10 ml)時，將底端出口伸入采樣瓶(6.2)中，打開底端活塞收集定性樣品。
7.1.2 定量樣品
按照 HJ/T 91 和 HJ 494 的相關(guān)規(guī)定進(jìn)行樣品的采集。
一般采集不少于 500 ml 樣品。當(dāng)水體中的浮游植物密度小于 106 cells/L，采集不少于 1L 樣品。
7.2 樣品的保存
7.2.1 定性樣品
定性樣品在 4 ℃——10 ℃冷藏避光條件下可保存 36 h。高溫環(huán)境下采集的定性樣品在保存前需逐漸降溫，避免溫度變化過快對浮游植物細(xì)胞產(chǎn)生損傷。
7.2.2 定量樣品
向每 1000 ml 定量樣品中加入 15 ml 魯哥氏液(5.4)。室溫避光條件下可保存 3 周；1 ℃——5 ℃冷藏避光條件下可保存 12 個月。
樣品在保存過程中，應(yīng)每周檢查魯哥氏液的氧化程度，如果樣品顏色變淺，則應(yīng)向樣品中補(bǔ)加適量魯哥氏液，直到樣品的顏色恢復(fù)為黃褐色。
若定量或定性樣品含大量有機(jī)質(zhì)、需儲存 12 個月以上時，應(yīng)加入甲醛溶液(5.3)固定，每 100 ml 樣品加 4 ml 甲醛溶液(5.3)。
8 分析步驟
8.1 混勻樣品
每次取樣前，必須采用上下顛倒至少 100 次的方式充分混勻所采樣品。
8.2 定性樣品的分析
在顯微鏡(6.3)下觀察定性樣品(7.1.1)，鑒定浮游植物的種類，并建立清單，為定量分析做好準(zhǔn)備。
根據(jù)調(diào)查的需要，確定需鑒定到的分類單位，一般情況下，鑒定到屬即可。
8.3 定量樣品的分析
8.3.1 調(diào)整浮游植物密度
8.3.1.1 樣品濃縮
當(dāng)定量樣品(7.1.2)中的浮游植物細(xì)胞密度小于 107 cells/L 時，需要對樣品進(jìn)行濃縮。
樣品中浮游植物細(xì)胞密度為 105 cells/L——106 cells/L 時，樣品濃縮 50 倍；樣品中浮游植物細(xì)胞密度為 106 cells/L——107 cells/L 時，樣品濃縮 10 倍。最終使?jié)饪s后加入計數(shù)框中的 0.1 ml樣品約含有 500 個——10000 個浮游植物細(xì)胞。樣品中浮游植物細(xì)胞密度的初步判斷可參照顯微鏡計數(shù)(8.3.2)進(jìn)行。
將全部定量樣品搖勻倒入濃縮裝置(6.4)中，靜置 48 h。用細(xì)小虹吸管吸取清液置于燒杯中，直至浮游植物沉淀物體積約 20 ml。旋開濃縮裝置(6.4)底部活塞，將浮游植物沉淀物放入 100 ml 量筒中。用少許清液沖洗濃縮裝置(6.4)1——3 次，一并放入量筒中，再用清液定容至所需濃縮倍數(shù)的體積。為了減少浮游植物吸附在濃縮裝置壁上，在靜置過程中，
應(yīng)適時輕敲濃縮裝置器壁。
8.3.1.2 樣品稀釋
當(dāng)定量樣品(7.1.2)中的浮游植物細(xì)胞密度大于 108 cells/L 時，需要對樣品進(jìn)行稀釋。
樣品中浮游植物細(xì)胞密度為 108 cells/L——109 cells/L 時，樣品稀釋 10 倍；樣品中浮游植物細(xì)胞密度大于 109 cells/L 時，樣品稀釋 100 倍。經(jīng)稀釋使加入計數(shù)框中的 0.1 ml 樣品約含有500 個——10000 個浮游植物細(xì)胞。樣品中浮游植物細(xì)胞密度的初步判斷可參照顯微鏡計數(shù)(8.3.2)進(jìn)行。
對于含有細(xì)胞聚集成團(tuán)的浮游植物樣品，當(dāng)不滿足以下兩個條件中的任何一個時，稀釋前需進(jìn)行超聲波處理：(1)群體中的浮游植物細(xì)胞個體較易被辨識，能夠?qū)θ后w中的細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)；(2)當(dāng)群體中所含細(xì)胞數(shù)量與群體體積或長度有固定比例時，如空星藻、盤星藻、絲狀藻等，可以將群體作為計數(shù)對象，依據(jù)比例得到浮游植物細(xì)胞數(shù)量。超聲波處理具體步驟為：取混勻的 30 ml 定量樣品于樣品瓶(6.5)中，用超聲波發(fā)生裝置(6.6)處理約 10 min 后，在顯微鏡下進(jìn)行觀察，如仍存在大量未分散的細(xì)胞團(tuán)，則需延長超聲波處理時間，直至能夠準(zhǔn)確計數(shù)。
根據(jù)稀釋倍數(shù)，選取相應(yīng)體積的容量瓶，量取不少于 25 ml 混勻后的定量樣品或經(jīng)超聲處理后的樣品，用水定容至刻線。如要保存稀釋后的樣品，應(yīng)注意補(bǔ)充魯哥氏液，使稀釋后樣品中的魯哥氏液濃度與稀釋前一致。
8.3.2 顯微鏡計數(shù)
8.3.2.1 準(zhǔn)備
將樣品放至室溫，用微量移液器(6.7)取 0.1 ml 混勻樣品，注入藻類計數(shù)框(6.8)中，用蓋玻片(6.9)將藻類計數(shù)框完全蓋住，靜置約 5 min 后，開始計數(shù)。藻類計數(shù)框內(nèi)應(yīng)無氣泡，如有氣泡應(yīng)重新取樣。
8.3.2.2 選取計數(shù)方式
根據(jù) 8.3.1 調(diào)整后的浮游植物的密度，選用合適的計數(shù)方式，使測定過程中浮游植物細(xì)胞的總計數(shù)量為 500 個——1500 個。表1為推薦選用的計數(shù)方式。
8.3.2.3 計數(shù)
8.3.2.3.1 全片計數(shù)方式
在 40×物鏡下，逐一觀察藻類計數(shù)框中全部 100 個小方格，分類計數(shù)每個小方格內(nèi)所有浮游植物細(xì)胞，并用計數(shù)器(6.10)記錄下每行的分類計數(shù)結(jié)果。若藻細(xì)胞體積較大，可降低物鏡倍數(shù)。
8.3.2.3.2 行格計數(shù)方式
在 40×物鏡下，逐一觀察藻類計數(shù)框中第 2、5、8 行，共 30 個小方格，分類計數(shù)每個小方格內(nèi)所有浮游植物細(xì)胞，并用計數(shù)器(6.10)記錄下每個小方格的分類計數(shù)結(jié)果。若藻細(xì)胞體積較大，可降低物鏡倍數(shù)。
8.3.2.3.3 對角線計數(shù)方式
在 40×物鏡下，逐一觀察位于藻類計數(shù)框?qū)蔷€位置上的 10 個小方格，分類計數(shù)每個小方格內(nèi)所有浮游植物細(xì)胞，并用計數(shù)器(6.10)記錄下每個小方格的分類計數(shù)結(jié)果。若藻細(xì)胞體積較大，可降低物鏡倍數(shù)。
8.3.2.3.4 隨機(jī)視野方式
在 40×物鏡下，隨機(jī)抽取一定數(shù)量的視野，分類計數(shù)每個視野內(nèi)所有浮游植物細(xì)胞，并記錄下每個視野的分類計數(shù)結(jié)果。若藻細(xì)胞體積較大，可降低物鏡倍數(shù)。計數(shù)前應(yīng)測量顯微鏡視野面積，測量方法參見附錄 B。
9 結(jié)果計算與表示
9.1 結(jié)果計算
樣品中浮游植物細(xì)胞密度(cells/L)，按照公式(1)進(jìn)行計算：
9.2 結(jié)果表示
測定結(jié)果以科學(xué)計數(shù)法表示，保留 2 位有效數(shù)字。
10 精密度
6家實(shí)驗(yàn)室分別用全片計數(shù)、行格計數(shù)、對角線計數(shù)和隨機(jī)視野計數(shù)對浮游植物密度為1×107 cells/L、3×107 cells/L、5×107 cells/L、1×108 cells/L 的實(shí)際樣品進(jìn)行了7次重復(fù)測定，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.4%——11%，2.9%——10%，2.7%——11%，4.8%——8.2%；實(shí)驗(yàn)室間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為22%、5.6%、7.1%、21%。計算測定結(jié)果對數(shù)值的 95%置信區(qū)間，再取反對數(shù)得到的實(shí)驗(yàn)室間95%置信區(qū)間見表2。
11 質(zhì)量保證和質(zhì)量控制
11.1 浮游植物均勻性
在開始顯微鏡計數(shù)前，應(yīng)確認(rèn)浮游植物在計數(shù)框中分布的均勻性。使用低倍數(shù)物鏡觀察浮游植物在整個計數(shù)框中的分布情況，若分布不均勻，應(yīng)重新取樣。
11.2 最少計數(shù)量
在單次測定中，浮游植物細(xì)胞計數(shù)總量不少于500個。當(dāng)發(fā)現(xiàn)測定精度難以達(dá)到要求時，可適當(dāng)增加每次測定中浮游植物細(xì)胞的計數(shù)總量。
11.3 精密度控制
每一樣品測定兩次。兩次計數(shù)結(jié)果相對偏差應(yīng)≤15%，否則應(yīng)增加計數(shù)一次，直至某兩次計數(shù)結(jié)果符合這一要求為止。測定結(jié)果為相對偏差≤15%的兩次計數(shù)結(jié)果的平均值。
12 注意事項(xiàng)
12.1 如遇到一個浮游植物細(xì)胞的一部分在行格或視野內(nèi)，而另一部分在行格或視野外，在行格上線或視野上半圈的細(xì)胞不計數(shù)，而在行格下線或視野下半圈的細(xì)胞計數(shù)。
12.2 計數(shù)過程中，如果發(fā)生樣品水分蒸發(fā)，在計數(shù)框中形成氣泡，則棄去本片重新取樣計數(shù)。
原標(biāo)題：關(guān)于征求《水質(zhì) 浮游植物的測定 顯微鏡計數(shù)法（征求意見稿）》等2項(xiàng)國家生態(tài)環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)意見的通知